巴拿马地区的印第安人对西班牙人殖民统治进行了激烈的反抗。正德十三年（1518年），巴拿马城周边的印第安人多次进攻城内的西班牙人，并摧毁了巴拿马城。但西班牙人凭借手中优良的武器装备，对巴拿马城周边的印第安人部落采取了各个击破的策略，杀死了25000多名印第安人，逐渐控制了巴拿马地峡。
  正德十四年（1519年），西班牙巴拿马总督佩德拉利亚斯杀了巴尔沃亚后，令部下迭戈·德·阿尔比特斯（Diego de Albites）去侦查北部海岸。阿尔比特斯率部到达北海岸后，发现奥杰达建造的诺姆布雷·德迪奥斯已经破败不堪，于是他重建了此城。
  诺姆布雷·德迪奥斯城重建后，佩德拉利亚斯下令筑一条从诺姆布雷·德迪奥斯城到巴拿马城的道路。阿尔比特斯就抓了4000多名印第安人来建造这条长60多公里的道路，筑路中，很多印第安人死于饥饿、疾病。当年七月，佩德拉利亚斯视察了建成的道路。西班牙人征服了秘鲁地区的印加帝国后，从秘鲁运来的金银财物在巴拿马卸船，然后用马匹、人力将货物沿着这条山路运到诺姆布雷·德迪奥斯城，再装船后运往西班牙。随着诺姆布雷·德迪奥斯港的不断繁荣，引起了海盗的眼馋，英国海盗分别于隆庆六年（1572年）、万历元年（1573年）劫掠了诺姆布雷·德迪奥斯港。由于受地形的限制，诺姆布雷·德迪奥斯港并不是便于防守的地方，在遭到2次大规模的劫掠后，西班牙人于万历二十五年（1597年）放火烧了诺姆布雷·德迪奥斯港，在波托韦洛湾圣玛利亚·德贝伦城的旧址上建造了一个新的港口，这个港口称为“圣菲利普·德·波托韦洛”（San Felipe de Puertovelo）。
  波托韦洛湾东西长约3公里，www.youxs.org，入口处水深30多米，码头处的水深也有14米，是个理想的深水港口，整个港湾能够同时300艘大帆船。为了加强对港口的防御，万历二十八年（1600年），西班牙人在海湾入口处的南、北海角修筑了碉堡，南边的叫圣地亚哥堡，有5门重炮，北边的叫圣菲利普堡，有35门重炮。尽管波托韦洛港有2个炮台守护，但也没能挡住胆大妄为的海盗的袭击，万历三十年（1602年），英国海盗冒充西班牙人，潜入波托韦洛城内，不仅抢了城内居民的财务，也劫掠了西班牙人的仓库，共抢走了12万个金币。海盗撤走了，西班牙殖民当局为保护城内的居民，在城西南不远处修筑了格罗里亚堡（Santiago deGloria），堡垒于（1604年）建成。今后，我们占领波托韦洛后，可以利用这些堡垒来保护港口、城市。
  正德十四年（1519年），西班牙人在修筑从诺姆布雷·德迪奥斯城到巴拿马城的道路时，佩德拉利亚斯下令重建巴拿马城。为了护卫巴拿马城，西班牙人在巴拿马城靠近海岸边的小岛上（今称东岛、西岛，距海岸仅700多米）建造了圣洛伦索（San Lorenzo）要塞。此后，巴拿马城成了西班牙人入侵秘鲁地区的基地。
  万历二十三年（1595年），西班牙人在巴拿马北海岸的查格雷斯河（Chagres River，也称恰格雷斯河）河口也建造了圣洛伦索城堡（Castillo de San Lorenzo，位于今巴拿马科隆港西12公里），以防止海盗沿查格雷斯河深入内陆劫掠。
  西班牙人占领巴拿马后，在印第安人贝拉瓜斯部落居住的区域（位于阿苏埃罗（Azuero）半岛北部）发现了大量砂金矿，于是殖民当局抓了很多印第安人开采砂金矿。大量印第安人死于劳役，殖民当局又运来黑人继续开采砂金矿。
  泰昌元年（1620年），西班牙人贝拉瓜斯地区发现了岩金矿，于是建造了圣地亚哥城（Santiago，在巴拿马城西南190里）。
  不过，由于西班牙人在墨西哥地区、秘鲁地区发现了大量金矿、银矿，因此并不热衷于在巴拿马地区找矿，西班牙人在巴拿马地区开采的金矿、银矿十分有限。
  西班牙人在加强对巴拿马、墨西哥地区的统治期间，也开始向中美洲地峡中部挺进。
  科尔特斯占领特诺奇提特兰（即墨西哥城）后，于嘉靖二年（1523年）十一月派手下佩德罗·德·阿尔瓦拉多（Pedro de Alvarado）前往危地马拉地区。
  危地马拉以山地为主，西北部有库丘马塔内斯山脉（Cuchumatanes Mountains），长400多公里，最高峰海拔3800多米；南部有马德雷山脉（Madre Mountains），是从墨西哥的恰帕斯地区延伸到危地马拉境内的。危地马拉有30多座火山，主要集中在马德雷山脉，最高的塔胡穆尔科火山（Tajumulco Volo）海拔约4220米。北部有佩滕低地，南部沿太平洋有狭窄的平原。北部及东部属热带雨林气候，南部山地属亚热带气候。一年分旱季、雨季两季，四月至九月为雨季，十月至次年三月为旱季，高山地区的气温在18c—28c之间，其它地方的气温比较高，东北部年降水量在2000-3000毫米之间，南部年降水量在500-1000毫米之间。危地马拉曾是玛雅文化的中心之一，土著人大多是玛雅人的后裔。
  阿尔瓦拉多率120名士兵、173匹马、4门大炮，首先来到了恰帕斯地区（注：今墨西哥恰帕斯州在西班牙殖民时代属于危地马拉，1824年才成为墨西哥的一个州），征服了那里的印第安人后，越过苏恰特河（Suchiate River，也称苏奇亚特河，今为墨西哥、危地马拉的界河）继续东征，途中遭到了6000基蒂族印第安人的阻击。印第安人首领特库姆—乌曼（Tecum Uman）亲自指挥作战，但这些从没见过马匹的玛雅人，根本不知道如何对付敌人的骑兵，也不知道对方射来的“炮弹”是什么东西？他们很快就被敌人打垮了，特库姆—乌曼也被西班牙人杀死了。特库姆—乌曼死后，玛雅人顿时没了主心骨，四处逃散，转入丛林与西班牙人战斗。阿尔瓦拉多恼怒之下，对周边的基蒂族人展开了大屠杀，经3个月的杀戮，有10余万基地族人遭到了屠0杀。阿尔瓦拉多的远征队在与基蒂族人的战斗中也损失了一些人，不得不休整。休整期间，科尔特斯向他派来了援兵。这次，阿尔瓦拉多带着135名骑兵、120名步兵、400名阿兹特克人（傀儡军）、4门火炮，向危地马拉高原进军，很快来到了玛雅人萨波蒂特兰（Zapotitn）城邦国境内。8400多名玛雅人在领主托托尼卡潘（Totonicap）的带领下，向入侵者发起了攻击，但他们没能挡住100多名西班牙人骑兵的冲击，在惨败中逃回了萨波蒂特兰城（今危地马拉雷塔卢莱乌省圣马丁·萨波蒂特兰城）。阿尔瓦拉多打败托托尼卡潘，率部进攻萨波蒂特兰城。防御萨波蒂特兰城的玛雅人只有弓箭、长矛，哪能抵得住持有火枪、大炮、利剑的西班牙人的进攻？托托尼卡潘不得不宣布投降。萨波蒂特兰城陷落后，附近的很多玛雅人部落知道抵抗也没啥用，就纷纷向阿尔瓦拉多表示臣服。
  阿尔瓦拉多率部继续东征，进入了萨马拉河（Sama River）河谷，这里是玛雅人基切城邦国的地盘。当西班牙人沿着河谷前行时，遭到了数千基切人的伏击。尽管地形不利于西班牙人的骑兵，但西班牙人凭着火力优势，突破了基切人的防线，进入了对自己有利的平原地区。而基切人不得不放弃主阵地，收缩到下一个山口继续阻击入侵者。几次战斗后，双方在奥林特佩克（Olintepeque）山谷（今危地马拉克萨尔特南戈省奥林特佩克镇附近）展开了决战。数万基切人将西班牙人包围在了山谷中，西班牙人假装撤退，把基切人引到了平原地带。上当的基切人追到平原地带时，遭到了西班牙人火枪、火炮的打击。尽管基切人穿着用盐水泡过的厚棉衣，但他们依然挡不住西班牙人的子弹、炮弹。随着伤亡的不断增多，基切人开始恐惧了，而这时西班牙人的骑兵猛冲了过来，彻底击溃了基切人的勇气。原本是基切人对西班牙人的包围战，变成了西班牙人对基切人的单方面屠杀。此战，基切城邦国的军队全军覆没。天亮后，西班牙人占领了无人防守的基切城邦国的都城谢拉胡伊（Sherahui，历史上，1902年谢拉胡伊城毁于火山喷发，重建后改名为克萨尔特南戈城（Quetzaltenango），为危地马拉克萨尔特南戈省首府）。阿尔瓦拉多占领谢拉胡伊城后，对基切人展开了报复。十几万基切人，最后只有数千人逃进密林才得以幸存。
  基切王国灭亡后，除了尤卡坦半岛的玛雅人外，危地马拉境内其它地区的玛雅人再也没敢抵抗西班牙人。尽管他们选择了投降，但西班牙殖民者也没有善待他们，不仅把他们视作奴隶，还会故意把天花患者的衣服、碗具等送给印第安人，导致危地马拉境内也爆发了天花，大量印第安人死去。
  阿尔瓦拉多占领危地马拉高原后，来到了阿瓜火山（阿瓜火山），在山脚下发现了一座城的废墟。当地的玛雅人告诉阿尔瓦拉多，这座火山叫“危地马拉”（Guatema，意为“喷火的山”），于是阿尔瓦拉多就在废墟上建造了一座新城，取名为“圣地亚哥城”，作为殖民者的统治中心。三年后（1527年），由于印第安人不断袭击“圣地亚哥城”内的西班牙人，于是殖民当局放弃了“圣地亚哥城”，在谢拉胡伊城南5公里的阿尔莫隆加火山脚下建造了“阿尔莫隆加城”（Almolonga），作为危地马拉都督府。嘉靖二十年（1521年），阿尔莫隆加地区发生了地震，强烈的地震引发了火山喷发，阿尔莫隆加被毁。阿尔莫隆加城重建后，嘉靖二十二年（1543年），西班牙人在阿尔莫隆加城东90公里的阿瓜斯火山（Aguas Volo）脚下建造了安提瓜危地马拉城（Antihua Guatema，今也称旧危地马拉城），然后把危地马拉都督府迁到了这里。万历十八年（1590年），一场地震摧毁了安提瓜危地马拉城，西班牙人重建了城市（历史上，1717年又一次地震摧毁了安提瓜危地马拉城，于是殖民当局于1775年在安提瓜危地马拉城东北25公里的地方新建了“圣地亚哥城”。1779年，圣地亚哥城作为危地马拉首府后，改名为“新危地马拉城”（La Nueau Guatema，即今危地马拉城），安提瓜危地马拉城就称为“旧危地马拉城”）。
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